FastKing Tek Adımda RT-PCR Kiti

A-1 RNA bozulur

——Yüksek kaliteli RNA'yı kontaminasyon olmadan arındırın. RNA'nın ekstrakte edildiği materyal, RNA bozulmasını önlemek için mümkün olduğunca taze olmalıdır. RT reaksiyonundan önce denatüre jel üzerinde RNA bütünlüğünü analiz edin. RNA ekstraksiyonundan sonra %100 formamid içinde saklanmalıdır. RNaz inhibitörü kullanılıyorsa, ısıtma sıcaklığı <45°C ve pH 8,0'dan düşük olmalıdır, aksi takdirde inhibitör bağlı tüm RNaz'ı serbest bırakacaktır. Ayrıca ≥ 0.8 mM DTT içeren solüsyonlara RNase inhibitörü eklenmelidir.

A-2 RNA, ters transkripsiyon reaksiyonlarının inhibitörlerini içerir

——Ters transkripsiyon inhibitörleri arasında SDS, EDTA, gliserol, sodyum pirofosfat, spermidin, formamid, guanidin tuzu vb. bulunur. Kontrol RNA'sını numune ile karıştırın ve bir inhibitör olup olmadığını kontrol etmek için verimi kontrol RNA reaksiyonu ile karşılaştırın. İnhibitörleri çıkarmak için RNA çökelmesini %70 (h/h) etanol ile yıkayın.

A-3 cDNA'nın ilk ipliğini sentezlemek için kullanılan primerlerin yetersiz tavlanması

——Tavlama sıcaklığının deneyde kullanılan primerler için uygun olduğunu belirleyin. Rastgele heksamerler için, reaksiyon sıcaklığına ulaşmadan önce sıcaklığın 10 dakika boyunca 25°C'de tutulması tavsiye edilir. Gene özgü primerler (GSP) için diğer GSP'yi deneyin veya oligo(dT) veya rastgele heksamere geçin.

A-4 Az miktarda başlangıç ​​RNA'sı

——RNA miktarını artırın. 50 ng'den küçük RNA örnekleri için, ilk iplikçik cDNA sentezinde 0,1 μg ila 0,5 μg asetil BSA kullanılabilir

A-5 Hedef dizi, analiz edilen dokularda ifade edilmez.

——Diğer dokuları deneyin.

A-6 PCR reaksiyonu başarısız

——İki adımlı RT-PCR için, PCR adımındaki cDNA şablonu reaksiyon hacminin 1/5'ini aşamaz.

A-1 Primerlerin ve şablonların spesifik olmayan tavlanması

——Astarların 3'-ucu 2-3 dG veya dC içermemelidir. İlk iplik sentezinde rastgele primerler veya oligo(dT) yerine Gene özgü primerleri kullanın. İlk birkaç döngüde daha yüksek bir tavlama sıcaklığı ve ardından daha düşük bir tavlama sıcaklığı kullanın. Reaksiyonun özgüllüğünü iyileştirmek için PCR için sıcak başlangıçlı Taq DNA polimeraz kullanın.

A-2 Gene özgü primerlerin zayıf tasarımı

—— Amplifikasyon primer tasarımı için aynı prensipleri takip edin.

A-3 RNA genomik DNA ile kontamine

——RNA'yı PCR dereceli DNase I ile tedavi edin. DNA kontaminasyonunu saptamak için ters transkripsiyon olmadan bir kontrol reaksiyonu kurun.

A-4 Primer dimerin oluşturulması

——3' ucunda tamamlayıcı dizileri olmayan tasarım primerleri.

A-5 Çok yüksek Mg²⁺ konsantrasyon

——Mg'yi Optimize Edin²⁺ her şablon ve astar kombinasyonu için konsantrasyon

A-6 Yabancı DNA ile kontamine

——Aerosol dirençli uçlar ve UDG enzimleri kullanın.

A-1 İlk iplik ürününün içeriği çok yüksek

——Geleneksel PCR reaksiyon adımındaki ilk iplik ürününün miktarını azaltın.

A-2 PCR reaksiyonunda çok yüksek primer miktarı

——Astar girişini azaltın.

A-3 Çok fazla döngü

——PCR reaksiyon koşullarını optimize edin ve PCR döngü sayısını azaltın.

A-4 Çok düşük tavlama sıcaklığı

——Spesifik olmayan başlatma ve uzatmayı önlemek için tavlama sıcaklığını artırın.

A-5 DNA'nın DNaz bozunmasıyla üretilen oligonükleotit fragmanlarının spesifik olmayan amplifikasyonu ——DNA kontaminasyonunu önlemek için yüksek kaliteli RNA'yı çıkarın.

RT-PCR, RNA'yı cDNA'ya ters kopyalamak ve ardından hedef parçayı büyütmek için PCR reaksiyonu için bir şablon olarak ters kopyalanan cDNA'yı kullanmaktır. Deneyin özel koşullarına göre rastgele primerler, Oligo dT ve gene özel primerler seçin. Yukarıdaki primerlerin tümü, saç tokası yapısı olmayan kısa ökaryotik hücre mRNA'sı için kullanılabilir.

Rastgele primer: Saç tokası yapılı uzun RNA'nın yanı sıra rRNA, mRNA, tRNA vb. her türlü RNA için uygundur. Esas olarak tek şablonun RT-PCR reaksiyonu için kullanılırlar.

Oligo dT: PolyA kuyruklu RNA için uygundur (prokaryotik RNA, ökaryotik Oligo dT rRNA ve tRNA, PolyA kuyruklarına sahip değildir). Oligo dT PolyA kuyruğuna bağlı olduğundan, RNA örneklerinin kalitesinin yüksek olması gerekir ve az miktarda bozulma bile tam uzunluktaki cDNA sentezi miktarını büyük ölçüde azaltacaktır.

Gen-spesifik primer: Hedef dizinin bilindiği durumlar için uygun, şablon diziyi tamamlayıcı.

İki yol var:

1. Dahili referans yöntemi: Teoride, cDNA, farklı uzunluklardaki DNA parçalarıdır, bu nedenle elektroforezin sonucu yaymadır. RNA bolluğu düşükse, elektroforezde hiçbir ürün gösterilmeyecektir, ancak bu, PCR ile hiçbir ürünün amplifiye edilmeyeceği anlamına gelmez. Genel olarak, cDNA'yı saptamak için dahili referans kullanılabilir. Dahili referansın sonuçları varsa, cDNA'nın kalitesi temel olarak garanti edilebilir (birkaç durumda, hedef gen parçası çok uzunsa istisnalar olabilir).

2. Bu şablon tarafından amplifiye edilen bilinen bir gen varsa, bu genin primerleri ile doğrulanabilir. Dahili referansın amplifikasyonu, mutlaka cDNA ile ilgili bir sorun olmadığı anlamına gelmez. Dahili referans cDNA'da yüksek bolluğa sahip olduğundan, amplifiye edilmesi kolaydır. Olasılık açısından cDNA'nın çeşitli nedenlerle kısmen parçalanması durumunda, düşük bolluktaki hedef genlerin PCR sonuçları büyük ölçüde etkilenecektir. Dahili referans hala yüksek olsa da, amplifikasyon muhtemelen etkilenmeyecektir.

RNA'nın kısmen bozulması. RNA'nın bütünlüğünü tespit edin ve saflaştırın

Farklı türlerin RNA içerikleri farklı olabilir, ancak genel olarak, ekstrakte edilen toplam RNA, jel elektroforezinde iki açık 28S ve 18S bandı içermelidir ve ilk bandın parlaklığı, ikincisininkinin iki katı kadar yüksek olmalıdır. 5S bandı, RNA'nın bozulduğunu ve parlaklığının bozulma derecesi ile orantılı olduğunu gösterir. Dahili referansın başarılı bir şekilde amplifikasyonu, RNA ile ilgili bir problem olmadığı anlamına gelmez, çünkü dahili referans yüksek miktarda olduğundan, RNA, bozulma şiddetli olmadığı sürece amplifiye edilebilir. OD₂₆₀/OD₂₈₀spektrofotometre ile ölçülen saf RNA oranı 1,9 ile 2,1 arasında olmalıdır. RNA'daki az miktarda protein safsızlığı oranı azaltacaktır. Değer çok düşük olmadığı sürece RT etkilenmeyecektir. RT için en önemli olan şey RNA bütünlüğüdür.

Dahili referans geninin uzantısı yalnızca RT'nin başarılı olduğunu gösterebilir, ancak bu mutlaka cDNA dizisinin kalitesi ile ilgili değildir. Dahili referans fragmanları genellikle küçük boyutlu ve ekspresyonları yüksek olduğundan, ters transkripsiyonda başarılı olmaları daha kolaydır. Ancak hedef genin boyutu ve ifadesi genden gene değişir. cDNA kalitesi, özellikle 2 kb'den uzun hedef fragmanlar için yalnızca dahili referansla değerlendirilemez.

Bazı numuneler karmaşık ikincil yapılara sahiptir veya zengin GC içeriğine sahiptir veya düşük bolluk ile değerlidir. Bu durumlarda, hedef parçanın ve numunenin boyutuna göre uygun ters transkriptaz seçilmelidir. Yüksek GC içeriğine ve karmaşık ikincil yapıya sahip RNA şablonları için ikincil yapıyı düşük sıcaklıkta veya ortak ters transkriptaz ile açmak zordur. Bu şablonlar için Quant Ters Transkriptaz seçilebilir, çünkü ters transkripsiyon performansı, çeşitli RNA şablonlarını verimli bir şekilde ters kopyalayabilen ve RNA'yı maksimum ölçüde cDNA birinci ipliğine kopyalayabilen M-MLV serisi ters transkriptazınkinden açıkça daha iyidir. Genel ters transkriptaz kiti kullanıldığında, 20 µl sistem sadece 1 µg toplam RNA'yı etkili bir şekilde tersine çevirebilir. Lütfen kitin maksimum RT kapasitesine dikkat edin. Şablon fazla eklenirse, ters transkripsiyon, yüksek bolluğa sahip RNA'yı destekleyecektir. Bu nedenle, sistemin maksimum kapasitesini aşmamak daha iyidir.

A-1 RNA'nın ciddi şekilde bozulup bozulmadığını ve RT'nin başarılı olup olmadığını belirleyin

Genel olarak, dahili referans amplifikasyonunun başarısızlığının nedeni genellikle ciddi RNA bozulmasından kaynaklanır. Başka bir olası neden, ters transkripsiyon hatasıdır. Dahili referans, cDNA tek sarmalının kalitesini yargılamak için bir standart olarak kullanılamaz, ancak RNA kalitesinde bir sorun yoksa ters transkripsiyonun başarılı olup olmadığını yargılamak için bir standart olarak kullanılabilir. Ters transkripsiyon işleminde en önemli şey, reaksiyon verimliliğini artırmak için sabit bir sıcaklık ve sabit bir reaksiyon sistemi sağlamaktır.

A-2 Dahili referans genlerini amplifiye etmek için kullanılan primerlerin güvenilir olup olmadığını ve PCR'de kullanılan reaktiflerle ilgili herhangi bir sorun olup olmadığını belirleyin.

Göreceli niceleme için, RNA, örneğin RNA girdisini 1 μg olarak ölçmek gibi birçok ters transkripsiyon kitinde de gerekli olan ters transkripsiyondan önce ölçülmelidir. Ters kopyalanan cDNA, RNA, oligo dT, enzim, dNTP ve hatta küçük bir DNA kalıntısı dahil olmak üzere karışık bir çözelti olduğundan sapmaya neden olacaktır, bu nedenle cDNA'yı doğru bir şekilde ölçmek imkansızdır. Bu nedenle, RNA kantifikasyonu gereklidir. Farklı örnekler arasında ters transkripsiyon etkinliğinin aynı olduğu göz önüne alındığında, elde edilen cDNA miktarının aynı olması gerekir ve kantitatif analiz, aynı miktarda toplam RNA'da farklı genlerin ekspresyon seviyelerinin karşılaştırmasını gösterebilir. Göreceli floresan kantitatif PCR gerçekleştirirken, iç referans geni referans olarak hareket edebileceğinden, ters transkripsiyondan sonra kantitatif cDNA gerekli olmayabilir.

Esas olarak genlerle ilgilidir ve uzun fragmanın ters transkripsiyonu çoğu gen için uygun değildir. İlk olarak, ters transkripsiyonun etkinliği, PCR'ninkinden çok daha düşüktür. İkinci olarak, birçok genin GC açısından zengin bölgesi ve ikincil yapısı, hem ters transkripsiyonu hem de PCR'yi kısıtlar. Son olarak, PCR'nin aslına uygunluğu ve amplifikasyon etkinliğinin aynı anda garanti edilmesi zordur. Ters transkripsiyon sürecinde, hiç kimse, özellikle oligo dT kullanarak, düşük kopyalı genler için uzun fragman elde etmeyi garanti edemez. Daha fazla GC'ye sahip 5' UTR'ye gelince, bu daha da zor. Bu nedenle, rasgele primerler ile transkript ters çevirmek, hedef parçadaki doğal bölünme bölgelerini bulmak, segmentlerle büyütmek ve ardından kısıtlama sindirimi ve ligasyonu gerçekleştirmek hala makul bir yöntemdir. Genel olarak, 2 kb'den büyük fragmanları doğrudan amplifiye etmek zordur, ancak elde etmek her zaman imkansız değildir: 1. Her şeyden önce, RNA/mRNA'nın bütünlüğünü garanti edin ve TRIZOL ekstraksiyonu tercih edilir. 2.M-MLV RT-PCR kiti doğrudan kullanılabilir. Amplifikasyon sürecinde tavlama süresini uzatın ve döngü sayısını uygun şekilde artırın. Alternatif olarak, yuvalanmış PCR uygulanabilir veya parçaların uzatılmasına yardımcı olabilecek normal PCR amplifikasyonundan önce uygun şekilde uzatılmış denatürasyon ve uzatma süresi ile ilk olarak bir veya iki reaksiyonu gerçekleştirebilir. Polimerazın aslına uygunluğuna dikkat edin. 3.Uzun Taq, ideal sonuçlar elde etmek için PCR'de kullanılabilir. 4.Protein ekspresyon uygulaması için yüksek kaliteli polimeraz uygulanmalıdır.

TIANGEN tarafından sunulan iki tür ters transkriptaz vardır: Quant/King RTase ve TIANScript M-MLV. Aralarındaki temel fark, şablonların giriş miktarıdır. Quant, Moloney murin lösemi virüsünden türetilen yaygın olarak kullanılan M-MLV'den farklı olan benzersiz bir ters transkriptazdır. Quant, mühendislik Escherichia coli tarafından rekombinant olarak ifade edilen yeni bir yüksek verimli ters transkriptazdır. Quant, yüksek ters transkripsiyonel aktivite ve yüksek verim ile 50 ng-2 μg RNA'nın amplifikasyonu için uygundur. Sıradan MMLV veya AMV ile karşılaştırıldığında, Quant'ın en büyük özelliği, RNA şablonları ile çok güçlü bir afiniteye sahip olması ve yüksek sıcaklıkta denatürasyon olmadan karmaşık şablonları tersine çevirebilmesidir. Daha yüksek GC içeriğine sahip şablonlar için ters verimlilik daha yüksektir. Ancak bu ters transkriptaz, cDNA ürününün uzunluğunu etkileyebilecek RNaz H aktivitesine sahiptir (<4.5 kb şablonlar için uygundur). Geleneksel ters transkripsiyon için TIANScript MMLV ters transkriptaz önerilir. Bu RTase, uzun (> 5 kb) cDNA sentezi için uygun olan, çok zayıf RNase H aktivitesine sahip modifiye edilmiş bir enzimdir.

Tek adımlı ters transkripsiyon ve PCR amplifikasyonu, cDNA sentezi ve amplifikasyon arasındaki tüp kapağını açmadan aynı tüpte tamamlanır, bu da kontaminasyonun azaltılmasına yardımcı olur. Elde edilen tüm cDNA örnekleri amplifikasyon için kullanıldığından, minimum 0.01 pg toplam RNA ile duyarlılık daha yüksektir. Başarılı tek adımlı RTPCR için, genellikle cDNA sentezini başlatmak için gene özgü primerler kullanılır. İki aşamalı yöntem, yani ters transkripsiyon ve PCR amplifikasyonu iki adımda gerçekleştirilir. İlk olarak, cDNA'yı elde etmek için bir RNA şablonundan ters transkripsiyon gerçekleştirilir ve elde edilen cDNA, bir veya daha fazla farklı PCR reaksiyonuna tabi tutulur. İki aşamalı yöntem, ilk cDNA dizisinin sentezine rehberlik etmek için oligo(dT) veya rastgele primerleri kullanabilir ve belirli bir numuneden tüm mRNA bilgilerini tersine çevirebilir.