Doğrudan Kan PCR Kiti

Hedef genin, ekstraksiyon olmadan doğrudan şablon olarak kan kullanılarak hızlı amplifikasyonu.

Bu kit, insan genomundaki tek kopya genleri verimli bir şekilde çoğaltmak için genetik olarak tasarlanmış bir anti-inhibitör DNA polimerazı kullanır. Bu kitteki iyi optimize edilmiş tampon sistemi, polimerazın PCR inhibitörlerinin inhibisyonuna güçlü bir şekilde direnmesine yardımcı olur, böylece şablon olarak kan ve kültürlenmiş hücreleri kullanarak DNA'yı doğrudan çoğaltabilir. Bu ürünün kullanımı kolaydır ve DNA saflaştırması veya numune ön işlemi gibi karmaşık adımlar gerektirmez.
Bu kit, 2×MasterMix olarak sağlanır ve reaksiyon, basitçe kan şablonu ve ilgili tespit primerleri eklenerek gerçekleştirilebilir. İnsanlar, fareler, domuzlar, sığırlar ve diğer türler gibi memelilerin kültürlenmiş hücrelerinin yanı sıra taze veya 4 ℃ kriyoprezerve edilmiş tam kan, antikoagülan (EDTA, sitrat, heparin), sıvılaştırılmış kan pıhtıları ve kuru kan lekeleri üzerine uygulanabilir. Whatman 903 ve FTA Elute ticari kartlarında saklanır.

Kedi. Numara	Paket boyutu
4992529	20 µl×100 rxn
4992530	20 µl×500 rxn

Bize e-posta gönder

Ürün ayrıntısı

Deneysel Örnek

SSS

Ürün etiketleri

Özellikleri

■ Basit ve hızlı: PCR amplifikasyonu, numune hazırlama ve DNA ekstraksiyonu gibi sıkıcı adımlara gerek kalmadan şablon olarak kan kullanılarak doğrudan gerçekleştirilebilir.
■ Yüksek saflık: Örnek ön işleme ve DNA ekstraksiyon adımlarının atlanması, örneklerin çapraz kontaminasyonunu önlemeye yardımcı olabilir.
■ Yüksek verim: Büyük ölçekli numuneler için PCR tanımlaması, kitin 96/384 oyuklu PCR plakaları ile birleştirilmesiyle gerçekleştirilebilir.
■ Güçlü evrensellik: Bu kit, yüksek GC fragmanlarını veya karmaşık ikincil yapıya sahip fragmanları verimli bir şekilde amplifiye edebilir ve amplifikasyon uzunluğu 5 kb'ye kadar olabilir.
■ Güçlü stres direnci: Bu kit, farklı şekillerde korunan çeşitli türler ve kan örnekleri için uygulanabilir.

Uygulamalar

Bu kitin PCR ürünleri, TA vektör klonlaması için doğrudan kullanılabilen 3' ucunda “A” içerir. Bu kit, genomik DNA fragmanlarının amplifikasyonu, yüksek verimli genetik analiz ve genotipleme (gen tespiti gibi) analizi için kullanılabilir.

Tüm ürünler ODM/OEM için özelleştirilebilir. Detaylar için,lütfen Özelleştirilmiş Hizmet'e tıklayın (ODM/OEM)

Öncesi: TIANcombi DNA Parçalama ve Det PCR Kiti

Sonraki: Fare Dokusu Doğrudan PCR Kiti

	Şablon olarak insan EDTA antikoagülasyonu kullanılarak, farklı GC içeriklerine sahip 4 gen Blood Direct PCR Kiti ile amplifiye edildi. PCR reaksiyon sistemi 20 µl idi ve şablon olarak 1 µl kan kullanıldı. M: TIANGEN İşaretleyici II; 1: Parça boyutu 1090 bp, GC içeriği %68,1; 2: Parça boyutu 1915 bp, GC içeriği %70.4; 3: Parça boyutu 448 bp, GC içeriği %74.8; 4: Parça boyutu 1527 bp, GC içeriği %61.5. Deneysel sonuçlar: Blood Direct PCR Kiti, %61.5-%74.8 aralığında GC içeriğine sahip DNA fragmanlarını etkili bir şekilde amplifiye edebilir, bu da yüksek GC fragmanlarını amplifiye edebildiğini gösterir.
	Şablon olarak insan EDTA antikoagülasyonu kullanılarak, farklı uzunluklarda (ActB, Prp, DN1.0, Hn2.0 ve Hn4.0) 5 gen Blood Direct PCR Kiti ile amplifiye edildi. PCR reaksiyon sistemi 20 µl idi ve şablon olarak 1 µl kan kullanıldı. M: TIANGEN İşaretleyici II; 1-3: 3 farklı kan örneği; NTC: primerler olmadan kontrol. Deneysel sonuçlar: Blood Direct PCR Kiti, 4 kb uzunluğa sahip fragmanları amplifiye edebilir, bu da uzun fragmanları amplifiye edebileceğini düşündürür.
	Şablon olarak insan EDTA antikoagülasyonu kullanılarak, farklı kan numunelerinin PCR tespiti için Blood Direct PCR Kiti kullanıldı. PCR reaksiyon sistemi 20 µl idi ve şablon olarak 1 µl kan kullanıldı. M: TIANGEN İşaretleyici II; 1-9: kanın yükleme miktarı sırasıyla 0,1 µl, 0,2 µl, 0,3 µl, 0,4 µl, 1 µl, 2 µl, 3 µl, 4 µl ve 5 µl'dir; NTC: şablonsuz kontrol Deneysel sonuçlar: Blood Direct PCR Kiti kana karşı güçlü bir dirence sahiptir ve 0,1-5 µl yükleme aralığı ile kan örneklerini çoğaltabilir.
	İnsan, sıçan, tavuk ve diğer türlerden farklı tedavilere sahip kan örnekleri şablon olarak kullanıldı. PRNP (insan, 750 bp), Actin (sıçan, 200 bp) ve β-Actin (Chicken, 1.0 kb) amplifikasyonu için Blood Direct PCR Kiti kullanıldı. PCR reaksiyon sistemi 20 µl idi ve şablon olarak 1 µl kan kullanıldı. M: TIANGEN İşaretleyici II. Deneysel sonuçlar: Blood Direct PCR Kiti geniş bir numune yelpazesine uygulanabilir ve farklı tedavilerle çeşitli türlerden alınan kan numuneleri üzerinde doğrudan PCR tespiti yapılabilir.

S: Amplifikasyon bandı yok

A-1 Şablonu

■ Şablon, protein safsızlıkları veya Taq inhibitörleri vb. içerir. ——DNA şablonunu saflaştırın, protein safsızlıklarını çıkarın veya saflaştırma kitleriyle şablon DNA'yı çıkarın.

■ Şablonun denatürasyonu tamamlanmadı ——Denatürasyon sıcaklığını uygun şekilde artırın ve denatürasyon süresini uzatın.

■ Şablon bozulması ——Şablonu yeniden hazırlayın.

A-2 Astar

■ Düşük kaliteli astar ——Astarı yeniden sentezleyin.

■ Primer bozulması ——Koruma için yüksek konsantrasyonlu primerleri küçük hacme bölün. Çoklu dondurma ve çözme işlemlerinden veya uzun süreli 4°C kriyoprezervasyondan kaçının.

■ Primerlerin uygun olmayan tasarımı (örneğin primer uzunluğu yetersiz, primerler arasında dimer oluşması vb.) - Primerleri yeniden tasarlayın (primer dimer ve sekonder yapı oluşumundan kaçının)

A-3 mg²⁺konsantrasyon

■ mg²⁺ konsantrasyon çok düşük —— Mg'yi uygun şekilde artırın²⁺konsantrasyon: Mg'yi optimize edin²⁺ optimal Mg'yi belirlemek için 0,5 mM aralıklarla 1 mM ila 3 mM arasında bir dizi reaksiyonla konsantrasyon²⁺ Her şablon ve astar için konsantrasyon.

A-4 Tavlama sıcaklığı

■ Yüksek tavlama sıcaklığı, astar ve şablonun bağlanmasını etkiler. ——Tavlama sıcaklığını düşürün ve durumu 2°C'lik bir gradyanla optimize edin.

A-5 Uzatma süresi

■ Kısa uzatma süresi——Uzatma süresini artırın.

S: Yanlış pozitif

Olgular: Negatif örnekler aynı zamanda hedef dizi bantlarını da gösterir.

A-1 PCR Kontaminasyonu

■ Hedef dizi veya amplifikasyon ürünlerinin çapraz kontaminasyonu ——Negatif numunede hedef dizi içeren numuneyi pipetlememeye veya santrifüj tüpünden dökmemeye dikkat edin. Reaktifler veya ekipman, mevcut nükleik asitleri ortadan kaldırmak için otoklavlanmalı ve kontaminasyonun varlığı negatif kontrol deneyleri ile belirlenmelidir.

■ Reaktif kontaminasyonu ——Reaktifleri alikotlayın ve düşük sıcaklıkta saklayın.

A-2 Başbakanr

■ mg²⁺ konsantrasyon çok düşük —— Mg'yi uygun şekilde artırın²⁺ konsantrasyon: Mg'yi optimize edin²⁺ optimal Mg'yi belirlemek için 0,5 mM aralıklarla 1 mM ila 3 mM arasında bir dizi reaksiyonla konsantrasyon²⁺ Her şablon ve astar için konsantrasyon.

■ Uygun olmayan primer tasarımı ve hedef sekans, hedef olmayan sekans ile homolojiye sahiptir. ——Astarları yeniden tasarlayın.

S: Spesifik olmayan amplifikasyon

Olgu: PCR amplifikasyon bantları, büyük veya küçük olmak üzere beklenen boyutla tutarsız veya bazen hem spesifik amplifikasyon bantları hem de spesifik olmayan amplifikasyon bantları meydana geliyor.

A-1 Astar

■ Zayıf primer özgüllüğü

——Astarı yeniden tasarlayın.

■ Primer konsantrasyonu çok yüksek ——Denatürasyon sıcaklığını uygun şekilde artırın ve denatürasyon süresini uzatın.

A-2 mg²⁺ konsantrasyon

■ Mg²⁺ konsantrasyon çok yüksek ——Mg2+ konsantrasyonunu uygun şekilde azaltın: Mg'yi optimize edin²⁺ optimal Mg'yi belirlemek için 0,5 mM aralıklarla 1 mM ila 3 mM arasında bir dizi reaksiyonla konsantrasyon²⁺ Her şablon ve astar için konsantrasyon.

A-3 Termostabil polimeraz

■ Aşırı enzim miktarı ——Enzim miktarını 0,5 U aralıklarla uygun şekilde azaltın.

A-4 Tavlama sıcaklığı

■ Tavlama sıcaklığı çok düşük —— Tavlama sıcaklığını uygun şekilde artırın veya iki aşamalı tavlama yöntemini benimseyin

A-5 PCR döngüleri

■ Çok fazla PCR döngüsü ——PCR döngüsü sayısını azaltın.

S: Yamalı veya lekeli bantlar

A-1 Astar——Kötü özgünlük ——Astarı yeniden tasarlayın, özgünlüğünü artırmak için astarın konumunu ve uzunluğunu değiştirin; veya yuvalanmış PCR gerçekleştirin.

A-2 Şablon DNA'sı

——Kalıp saf değil —— Kalıbı saflaştırın veya saflaştırma kitleriyle DNA'yı çıkarın.

A-3 mg²⁺ konsantrasyon

--Mg²⁺ konsantrasyon çok yüksek ——Mg'yi uygun şekilde azaltın²⁺ konsantrasyon: Mg'yi optimize edin²⁺ optimal Mg'yi belirlemek için 0,5 mM aralıklarla 1 mM ila 3 mM arasında bir dizi reaksiyonla konsantrasyon²⁺ Her şablon ve astar için konsantrasyon.

A-4 dNTP

——dNTP konsantrasyonu çok yüksek ——dNTP konsantrasyonunu uygun şekilde azaltın

A-5 Tavlama sıcaklığı

——Çok düşük tavlama sıcaklığı —— Tavlama sıcaklığını uygun şekilde artırın

A-6 Döngüleri

——Çok fazla döngü ——Döngü sayısını optimize edin

S: 50 µl PCR reaksiyon sistemine ne kadar şablon DNA eklenmelidir?

S: Uzun parçalar nasıl amplifiye edilir?

İlk adım, uygun polimerazı seçmektir. Normal Taq polimeraz, 3'-5' eksonükleaz aktivitesinin olmaması nedeniyle düzeltme okuyamaz ve uyumsuzluk, parçaların uzama etkinliğini büyük ölçüde azaltacaktır. Bu nedenle, düzenli Taq polimeraz, 5 kb'den büyük hedef fragmanları etkili bir şekilde çoğaltamaz. Özel modifikasyonlu Taq polimeraz veya diğer yüksek kaliteli polimeraz, uzatma etkinliğini artırmak ve uzun fragman amplifikasyonunun ihtiyaçlarını karşılamak için seçilmelidir. Ek olarak, uzun fragmanların amplifikasyonu aynı zamanda primer tasarımının, denatürasyon süresinin, uzatma süresinin, tampon pH'ının vs. uygun şekilde ayarlanmasını gerektirir. Genellikle 18-24 bp'lik primerler daha iyi verime yol açabilir. Şablon hasarını önlemek için, 94°C'deki denatürasyon süresi döngü başına 30 saniye veya daha azına düşürülmeli ve amplifikasyondan önce sıcaklığın 94°C'ye yükselme süresi 1 dakikadan az olmalıdır. Ayrıca, uzatma sıcaklığının yaklaşık 68°C'ye ayarlanması ve uzatma süresinin 1 kb/dk hızına göre tasarlanması, uzun fragmanların etkin amplifikasyonunu sağlayabilir.

S: PCR'nin amplifikasyon aslına uygunluğu nasıl geliştirilir?

PCR amplifikasyonunun hata oranı, yüksek doğrulukla çeşitli DNA polimerazları kullanılarak azaltılabilir. Şimdiye kadar bulunan tüm Taq DNA polimerazları arasında Pfu enzimi en düşük hata oranına ve en yüksek güvenilirliğe sahiptir (ekli tabloya bakınız). Enzim seçimine ek olarak araştırmacılar, tampon bileşimini optimize etme, termostabil polimeraz konsantrasyonu ve PCR döngü sayısını optimize etme dahil olmak üzere reaksiyon koşullarını optimize ederek PCR mutasyon oranını daha da azaltabilirler.

Mesajınızı buraya yazın ve bize gönderin