2×Pfu PCR Karışımı

A-1 Şablonu

■ Şablon, protein safsızlıkları veya Taq inhibitörleri vb. içerir. ——DNA şablonunu saflaştırın, protein safsızlıklarını çıkarın veya saflaştırma kitleriyle şablon DNA'yı çıkarın.

■ Şablonun denatürasyonu tamamlanmadı ——Denatürasyon sıcaklığını uygun şekilde artırın ve denatürasyon süresini uzatın.

■ Şablon bozulması ——Şablonu yeniden hazırlayın.

A-2 Astar

■ Düşük kaliteli astar ——Astarı yeniden sentezleyin.

■ Primer bozunması ——Koruma için yüksek konsantrasyonlu primerleri küçük hacme bölün. Çoklu dondurma ve çözme işlemlerinden veya uzun süreli 4°C kriyoprezervasyondan kaçının.

■ Primerlerin uygun olmayan tasarımı (örneğin primer uzunluğu yetersiz, primerler arasında dimer oluşması vb.) - Primerleri yeniden tasarlayın (primer dimer ve sekonder yapı oluşumundan kaçının)

A-3 mg²⁺konsantrasyon

■ mg²⁺ konsantrasyon çok düşük —— Mg'yi uygun şekilde artırın²⁺ konsantrasyon: Mg'yi optimize edin²⁺ optimal Mg'yi belirlemek için 0,5 mM aralıklarla 1 mM ila 3 mM arasında bir dizi reaksiyonla konsantrasyon²⁺ Her şablon ve astar için konsantrasyon.

A-4 Tavlama sıcaklığı

■ Yüksek tavlama sıcaklığı, astar ve şablonun bağlanmasını etkiler. ——Tavlama sıcaklığını düşürün ve durumu 2°C'lik bir gradyanla optimize edin.

A-5 Uzatma süresi

■ Kısa uzatma süresi——Uzatma süresini artırın.

Olgular: Negatif örnekler aynı zamanda hedef dizi bantlarını da gösterir.

A-1 PCR Kontaminasyonu

■ Hedef dizi veya amplifikasyon ürünlerinin çapraz kontaminasyonu ——Negatif numunede hedef dizi içeren numuneyi pipetlememeye veya santrifüj tüpünden dökmemeye dikkat edin. Reaktifler veya ekipman, mevcut nükleik asitleri ortadan kaldırmak için otoklavlanmalı ve kontaminasyonun varlığı negatif kontrol deneyleri ile belirlenmelidir.

■ Reaktif kontaminasyonu ——Reaktifleri alikotlayın ve düşük sıcaklıkta saklayın.

A-2 Başbakanr

■ mg²⁺ konsantrasyon çok düşük —— Mg'yi uygun şekilde artırın²⁺ konsantrasyon: Mg'yi optimize edin²⁺ optimal Mg'yi belirlemek için 0,5 mM aralıklarla 1 mM ila 3 mM arasında bir dizi reaksiyonla konsantrasyon²⁺ Her şablon ve astar için konsantrasyon.

■ Uygun olmayan primer tasarımı ve hedef sekans, hedef olmayan sekans ile homolojiye sahiptir. ——Astarları yeniden tasarlayın.

Olgu: PCR amplifikasyon bantları, büyük veya küçük olmak üzere beklenen boyutla tutarsız veya bazen hem spesifik amplifikasyon bantları hem de spesifik olmayan amplifikasyon bantları meydana geliyor.

A-1 Astar

■ Zayıf primer özgüllüğü

——Astarı yeniden tasarlayın.

■ Primer konsantrasyonu çok yüksek ——Denatürasyon sıcaklığını uygun şekilde artırın ve denatürasyon süresini uzatın.

A-2 mg²⁺ konsantrasyon

■ Mg²⁺ konsantrasyon çok yüksek ——Mg2+ konsantrasyonunu uygun şekilde azaltın: Mg'yi optimize edin²⁺ optimal Mg'yi belirlemek için 0,5 mM aralıklarla 1 mM ila 3 mM arasında bir dizi reaksiyonla konsantrasyon²⁺ Her şablon ve astar için konsantrasyon.

A-3 Termostabil polimeraz

■ Aşırı enzim miktarı ——Enzim miktarını 0,5 U aralıklarla uygun şekilde azaltın.

A-4 Tavlama sıcaklığı

■ Tavlama sıcaklığı çok düşük —— Tavlama sıcaklığını uygun şekilde artırın veya iki aşamalı tavlama yöntemini benimseyin

A-5 PCR döngüleri

■ Çok fazla PCR döngüsü ——PCR döngüsü sayısını azaltın.

A-1 Astar——Kötü özgünlük ——Astarı yeniden tasarlayın, özgünlüğünü artırmak için astarın konumunu ve uzunluğunu değiştirin; veya yuvalanmış PCR gerçekleştirin.

A-2 Şablon DNA'sı

——Kalıp saf değil —— Kalıbı saflaştırın veya saflaştırma kitleriyle DNA'yı çıkarın.

A-3 mg²⁺ konsantrasyon

--Mg²⁺ konsantrasyon çok yüksek ——Mg'yi uygun şekilde azaltın²⁺ konsantrasyon: Mg'yi optimize edin²⁺ optimal Mg'yi belirlemek için 0,5 mM aralıklarla 1 mM ila 3 mM arasında bir dizi reaksiyonla konsantrasyon²⁺ Her şablon ve astar için konsantrasyon.

A-4 dNTP

——dNTP konsantrasyonu çok yüksek ——dNTP konsantrasyonunu uygun şekilde azaltın

A-5 Tavlama sıcaklığı

——Çok düşük tavlama sıcaklığı —— Tavlama sıcaklığını uygun şekilde artırın

A-6 Döngüleri

——Çok fazla döngü ——Döngü sayısını optimize edin

İlk adım, uygun polimerazı seçmektir. Normal Taq polimeraz, 3'-5' eksonükleaz aktivitesinin olmaması nedeniyle düzeltme okuyamaz ve uyumsuzluk, parçaların uzama etkinliğini büyük ölçüde azaltacaktır. Bu nedenle, düzenli Taq polimeraz, 5 kb'den büyük hedef fragmanları etkili bir şekilde çoğaltamaz. Özel modifikasyonlu Taq polimeraz veya diğer yüksek kaliteli polimeraz, uzatma etkinliğini artırmak ve uzun fragman amplifikasyonunun ihtiyaçlarını karşılamak için seçilmelidir. Ek olarak, uzun fragmanların amplifikasyonu aynı zamanda primer tasarımının, denatürasyon süresinin, uzatma süresinin, tampon pH'ının vs. uygun şekilde ayarlanmasını gerektirir. Genellikle 18-24 bp'lik primerler daha iyi verime yol açabilir. Şablon hasarını önlemek için, 94°C'deki denatürasyon süresi döngü başına 30 saniye veya daha azına düşürülmeli ve amplifikasyondan önce sıcaklığın 94°C'ye yükselme süresi 1 dakikadan az olmalıdır. Ayrıca, uzatma sıcaklığının yaklaşık 68°C'ye ayarlanması ve uzatma süresinin 1 kb/dk hızına göre tasarlanması, uzun fragmanların etkin amplifikasyonunu sağlayabilir.

PCR amplifikasyonunun hata oranı, yüksek doğrulukla çeşitli DNA polimerazları kullanılarak azaltılabilir. Şimdiye kadar bulunan tüm Taq DNA polimerazları arasında Pfu enzimi en düşük hata oranına ve en yüksek güvenilirliğe sahiptir (ekli tabloya bakınız). Enzim seçimine ek olarak araştırmacılar, tampon bileşimini optimize etme, termostabil polimeraz konsantrasyonu ve PCR döngü sayısını optimize etme dahil olmak üzere reaksiyon koşullarını optimize ederek PCR mutasyon oranını daha da azaltabilirler.