TIANSeq Örgülü RNA-Seq Kiti (illumina)

Şu anda, yüksek verimli sıralama teknolojisi, esas olarak yeni nesil sıralama teknolojisine dayanmaktadır. Yeni nesil dizileme teknolojisinin okuma uzunluğu sınırlı olduğundan, dizilemek için tam uzunlukta diziyi küçük parça kitaplıklarına bölmeliyiz. Farklı sıralama deneylerinin ihtiyaçlarına göre, genellikle tek uçlu sıralama veya çift uçlu sıralama seçeriz. Şu anda yeni nesil dizileme kitaplığının DNA fragmanları genellikle 200-800 bp aralığında dağıtılır.

a) DNA kalitesizdir ve inhibitörler içerir. Enzim aktivitesinin inhibisyonunu önlemek için yüksek kaliteli DNA örnekleri kullanın.

b) DNA kütüphanesi oluşturmak için PCR'siz yöntem kullanıldığında DNA numunesi miktarı yetersizdir. Parçalanmış DNA girişi 50 ng'yi aştığında, kütüphane oluşturma işlemi sırasında PCR'siz iş akışı seçici olarak gerçekleştirilebilir. Kitaplığın kopya sayısı doğrudan dizilenemeyecek kadar düşükse, DNA kitaplığı adaptör ligasyonundan sonra PCR ile amplifiye edilebilir.

c) RNA kontaminasyonu hatalı başlangıç ​​DNA kantifikasyonuna yol açar Genomik DNA'nın saflaştırma işleminde RNA kontaminasyonu mevcut olabilir, bu da yanlış DNA ölçümüne ve kütüphane yapımı sırasında yetersiz DNA yüklemesine yol açabilir. RNA, RNase ile tedavi edilerek çıkarılabilir.

A-1

a) Küçük parçalar (60 bp-120 bp) görünüyor Küçük parçalar genellikle adaptör parçaları veya adaptörler tarafından oluşturulan dimerlerdir. Agencourt AMPure XP manyetik boncuklarla saflaştırma, bu adaptör parçalarını etkili bir şekilde çıkarabilir ve sıralama kalitesini garanti edebilir.

b) PCR amplifikasyonundan sonra kütüphanede büyük fragmanlar görünüyor Adaptör bağlandıktan sonra kütüphane DNA fragmanının boyutu 120 bp artacaktır. Adaptör ligasyonundan sonra DNA fragmanı 120 bp'den fazla artarsa, bunun nedeni aşırı PCR amplifikasyonunun anormal fragman amplifikasyonu olabilir. PCR döngülerinin sayısını azaltmak durumu önleyebilir.

c) Adaptör ligasyonundan sonra kitaplık DNA fragmanlarının anormal boyutu Bu kitteki adaptörün uzunluğu 60 bp'dir. Parçanın iki ucu adaptörlere bağlandığında, uzunluk sadece 120 bp artacaktır. Bu kit tarafından sağlanandan farklı bir adaptör kullandığınızda, adaptör uzunluğu gibi ilgili bilgileri sağlamak için lütfen tedarikçi ile iletişime geçin. Lütfen deney iş akışının ve çalışmasının kılavuzda açıklanan adımları izlediğinden emin olun.

d) Adaptör ligasyonu öncesi anormal DNA fragman boyutu Bu sorunun nedeni, DNA fragmantasyonu sırasında yanlış reaksiyon koşullarından kaynaklanıyor olabilir. Farklı DNA girişi için farklı reaksiyon süreleri kullanılmalıdır. DNA girişi 10 ng'den fazlaysa, optimizasyon için başlangıç ​​zamanı olarak 12 dakikalık reaksiyon süresinin seçilmesini öneririz ve bu sırada üretilen parça boyutu esas olarak 300-500 bp aralığındadır. Kullanıcılar, DNA fragmanlarını gerekli boyutta optimize etmek için kendi gereksinimlerine göre DNA fragmanlarının uzunluğunu 2-4 dakika artırabilir veya azaltabilir.

A-2

a) Parçalanma süresi optimize edilmemiş Parçalanmış DNA çok küçük veya çok büyükse, reaksiyon süresini belirlemek için lütfen talimatta verilen Parçalanma Süresi Seçimi Kılavuzuna bakın ve bu zaman noktasını bir kontrol olarak kullanın, ayrıca bir Parçalanma süresinde daha doğru ayarlama yapmak için 3 dakikayı uzatmak veya kısaltmak için reaksiyon sistemi.

A-3

Parçalanma işleminden sonra DNA'nın anormal boyut dağılımı

a) Fragmentasyon reaktifinin yanlış çözdürme yöntemi veya reaktifin çözdürülmesinden sonra tamamen karışmaması. 5× Fragmentation Enzyme Mix reaktifini buz üzerinde çözün. Çözüldükten sonra reaktifi tüpün altını hafifçe vurarak eşit şekilde karıştırın. Reaktifi vortekslemeyin!

b) DNA giriş numunesi EDTA veya diğer kirleticiler içeriyor DNA saflaştırma adımında tuz iyonlarının ve şelatlama maddelerinin tükenmesi, deneyin başarısı için özellikle önemlidir. DNA 1×TE içinde çözülürse, parçalama gerçekleştirmek için talimatta verilen yöntemi kullanın. Çözeltideki EDTA konsantrasyonu belirsizse, sonraki reaksiyon için DNA'nın saflaştırılması ve deiyonize suda çözülmesi önerilir.

c) Hatalı ilk DNA miktar tayini Parçalanmış DNA'nın boyutu, DNA girişi miktarı ile yakından ilişkilidir. Parçalanma işleminden önce, Qubit, Picogreen ve diğer yöntemler kullanılarak DNA'nın doğru bir şekilde ölçülmesi, reaksiyon sistemindeki DNA'nın tam miktarını belirlemek için gereklidir.

 d) Reaksiyon sisteminin hazırlanması talimata uygun değildir Parçalanmış reaksiyon sisteminin hazırlanması kesinlikle talimatlara göre buz üzerinde yapılmalıdır. En iyi etkiyi sağlamak için tüm reaksiyon bileşenleri buz üzerine yerleştirilmeli ve tamamen soğumadan sonra reaksiyon sistemi hazırlanmalıdır. Hazırlık tamamlandıktan sonra, iyice karıştırmak için lütfen hafifçe vurun veya pipetleyin. Girdap etmeyin!

1. Uygun olmayan karıştırma yöntemi (girdap, şiddetli salınım vb.) kitaplık parçalarının anormal dağılımına (aşağıdaki şekilde gösterildiği gibi) neden olarak kitaplığın kalitesini etkiler. Bu nedenle, Fragmentation Mix reaksiyon solüsyonunu hazırlarken, karıştırmak için lütfen hafifçe pipetleyin ve eşit şekilde karıştırın veya parmak ucunu hafifçe vurarak karıştırın. Vorteks ile karıştırmamaya dikkat edin.

2. Kütüphane yapımı için yüksek saflıkta DNA kullanılmalıdır

■ İyi DNA bütünlüğü: Elektroforez bandı, kuyruksuz 30 kb'den fazladır

■ OD260/230: >1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. DNA giriş miktarı doğru olmalıdır DNA'yı ölçmek için Nanodrop yerine Qubit ve PicoGreen yöntemlerinin kullanılması önerilir.

4. DNA solüsyonundaki EDTA içeriği belirlenmelidir. EDTA'nın parçalanma reaksiyonu üzerinde büyük etkisi vardır. EDTA içeriği yüksekse, sonraki testten önce DNA saflaştırması yapılmalıdır.

5. Parçalanma reaksiyonu çözeltisi buz üzerinde hazırlanmalıdır Parçalama işlemi, reaksiyon sıcaklığına ve süresine duyarlıdır (özellikle güçlendirici ilave edildikten sonra). Reaksiyon süresinin doğruluğunu sağlamak için lütfen buz üzerinde reaksiyon sistemi hazırlayın.

6. Parçalanma tepkime süresi doğru olmalıdır Parçalanma aşamasının tepkime süresi, parça ürünlerinin boyutunu doğrudan etkileyecek ve böylece kitaplıktaki DNA parçalarının boyut dağılımını etkileyecektir.

1. Bu kite ne tür bir numune uygulanabilir?

Bu kitin geçerli örnek tipi, toplam RNA veya iyi RNA bütünlüğüne sahip saflaştırılmış mRNA olabilir. Kitaplığı oluşturmak için toplam RNA kullanılıyorsa, önce rRNA'yı çıkarmak için rRNA tükenme kitinin (Cat#4992363/4992364/4992391) kullanılması önerilir.

2. FFPE örnekleri bu kit ile kitaplık oluşturmak için kullanılabilir mi?

FFPE numunelerindeki mRNA, göreceli olarak zayıf bütünlük ile belirli bir dereceye kadar bozulacaktır. Bu kiti kitaplık yapımı için kullanırken, parçalanma süresinin optimize edilmesi önerilir (parçalanma süresini kısaltmak veya parçalama yapmamak).

3. Ürün kılavuzunda verilen beden seçimi adımını kullanarak, eklenen segmentin hafif sapma göstermesine ne sebep olabilir?

Beden seçimi, bu ürün kılavuzundaki beden seçimi adımına sıkı sıkıya bağlı kalınarak yapılacaktır. Sapma varsa bunun nedeni manyetik boncukların oda sıcaklığına göre dengelenmemiş olması veya tam karışmamış olması, pipetin doğru olmaması veya sıvının uçta kalması olabilir. Deney için düşük adsorpsiyonlu uçların kullanılması tavsiye edilir.

4. Kütüphane yapımında adaptör seçimi

Kitaplık yapım kiti adaptör reaktifi içermez ve bu kitin TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina)(4992641/4992642/4992378) ile birlikte kullanılması önerilir.

5. Kütüphanenin Kalite Kontrolü

Kütüphane kantitatif tespiti: Qubit ve qPCR, kütüphanenin sırasıyla kütle konsantrasyonunu ve molar konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır. İşlem kesinlikle ürün kılavuzuna uygundur. Kütüphanenin konsantrasyonu genellikle NGS dizilemesinin gereksinimlerini karşılayacaktır. Kütüphane dağıtım aralığının tespiti: Kütüphane dağıtım aralığının tespit edilmesi için Agilent 2100 Bioanalyzer kullanılması.

6. Amplifikasyon döngü numarası seçimi

Talimatlara göre PCR döngü sayısı 6-12'dir ve ihtiyaç duyulan PCR döngü sayısı numune girişine göre seçilmelidir. Yüksek verimli kitaplıklarda, aşırı amplifikasyon genellikle değişen derecelerde meydana gelir; bu, Agilent 2100 Bioanalyzer tespitinde hedef aralığın zirvesinden sonra biraz daha büyük bir zirve ile kendini gösterir veya tespit edilen Qubit konsantrasyonu, qPCR'ninkinden düşüktür. Hafif aşırı amplifikasyon, kitaplık sıralamasını ve sonraki veri analizini etkilemeyen normal bir olgudur.

7. Agilent 2100 Bioanalyzer'ın algılama profilinde sivri uçlar görünüyor

Agilent 2100 Bioanalyzer saptamasında sivri uçların görünümü, belirli boyutta daha fazla parçanın olacağı numunelerin düzensiz parçalanmasından kaynaklanmaktadır ve bu, PCR zenginleştirme işleminden sonra daha belirgin hale gelecektir. Bu durumda, boyut seçiminin yapılmaması, yani fragman dağılımının küçük ve konsantre olduğu ve homojenliğin geliştirilebileceği inkübe edilmiş 15 dakika boyunca fragmantasyon koşulunun 94°C'ye ayarlanması önerilir.